5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一種新型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠促進多種果實花青苷合成。現(xiàn)有研究表明，MYB、WRKY、MADS、NAC、EFR等轉(zhuǎn)錄因子參與ALA誘導(dǎo)的蘋果花青苷合成。但是，ALA代謝本身是否參與果實花青苷積累過程，迄今還未見報道。為明確這一可能性，本研究通過遺傳學(xué)、藥物學(xué)和分子生物學(xué)手段研究揭示，ALA代謝至血紅素的鐵螯合酶編碼基因MdFC2在ALA誘導(dǎo)花青苷合成過程中發(fā)揮著重要作用。

1）蘋果MdFC2進化樹分析

在蘋果（Malus × domestica）基因組中，血紅素合成酶（FC）存在兩種亞型，即FC1和FC2。RT-qPCR結(jié)果顯示，ALA能顯著增強MdFC2的轉(zhuǎn)錄水平（圖1A）。為了深入理解不同物種FC基因的親緣關(guān)系，我們構(gòu)建了一個包含11個物種的FC基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖1B）。結(jié)果顯示，這些物種FC均由兩個基因編碼。哺乳動物兩種FC蛋白均定位于線粒體，可分為亞型1和亞型2。在高等植物中，F(xiàn)C1是管家酶，負責(zé)包括質(zhì)體和線粒體在內(nèi)的整個細胞血紅素供應(yīng)，而FC2則主要參與葉綠體光合機構(gòu)血紅素合成。植物FC1與FC2之間的差別主要體現(xiàn)在N端和C端的氨基酸序列。在包括單子葉、雙子葉以及草本和木本植物在內(nèi)的8種高等植物中，F(xiàn)C2的C端有超過80個氨基酸殘基相似度高達94.30%。在這高度保守區(qū)域中，有23個氨基酸殘基屬于類囊體膜光捕獲復(fù)合物（LHC），暗示著FC2蛋白除了螯合鐵離子生成血紅素外，還與葉綠體的吸光特性有關(guān)。這是FC1蛋白所不具備的。此外，亞細胞定位分析顯示，35S::MdFC2 的GFP信號與葉綠素分布一致，證實MdFC2是一種葉綠體蛋白（圖1C）。

 蘋果FC表達對ALA的響應(yīng)及其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與特征分析

2）ALA正向調(diào)控蘋果MdFC2的表達

光照條件下，蘋果葉片和愈傷細胞花青素含量上升，外源ALA處理進一步促進花青苷積累，而且ALA誘導(dǎo)的果皮花青素積累與MdFC2基因表達存在著正相關(guān)關(guān)系。將MdFC2啟始密碼子上游2000 bp啟動子序列克隆到GUS報告基因上游，瞬時轉(zhuǎn)化蘋果葉片，并用ALA處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALA處理顯著提高MdFC2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，說明MdFC2表達受到ALA正調(diào)控（圖2）。

 ALA正向調(diào)控蘋果MdFC2的表達

3）MdFC2介導(dǎo)ALA誘導(dǎo)的花青苷積累

為了解析MdFC2在ALA誘導(dǎo)的蘋果花青素積累中的功能，我們構(gòu)建MdFC2過表達（OE-MdFC2）和干擾表達（RNAi-MdFC2）載體，經(jīng)農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化至蘋果果皮或葉片，或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化至‘王林’蘋果愈傷組織。結(jié)果表明，OE-MdFC2顯著提高蘋果花青素含量，ALA具有協(xié)同增效作用；相反，RNAi-MdFC2導(dǎo)致蘋果花青素含量顯著降低，而ALA能緩解這種抑制效應(yīng)，說明MdFC2是ALA誘導(dǎo)蘋果花青苷合成過程中的關(guān)鍵基因。

MdFC2參與ALA誘導(dǎo)蘋果花青苷的生物合成功能分析

4）DPD抑制ALA誘導(dǎo)的花青素積累

為了進一步驗證MdFC2在ALA誘導(dǎo)花青苷的過程中的作用，我們用2,2‘-二硫代二吡啶（DPD，一種鐵螯合酶活性抑制劑）處理蘋果葉片以及愈傷組織。結(jié)果顯示，與ALA單獨處理相比，無論哪個體系，DPD均能抑制花青苷積累。再次印證，MdFC2為ALA誘導(dǎo)蘋果花青苷積累所必需。

 MdFC2參與ALA誘導(dǎo)蘋果花青苷的生物合成功能分析

綜上所述，我們報道血紅素合成關(guān)鍵基因MdFC2在ALA誘導(dǎo)的蘋果花青素積累中起到重要作用。外源ALA顯著促進MdFC2轉(zhuǎn)錄，后者進一步促進下游包括轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（如MdMYB10、MdTTG1和MdMADS1）、花青苷生物合成結(jié)構(gòu)基因（如MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS和MdUFGT）以及轉(zhuǎn)運基因（如MdGSTF12和MdMATE8）表達。這些結(jié)果表明，ALA調(diào)節(jié)花青素積累可能涉及多個介入點以及多條信號傳導(dǎo)途徑。這為ALA促進蘋果花青素積累機制研究提供了新的視角。它不僅豐富了我們對蘋果花青素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，也為ALA在果品生產(chǎn)上應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

作者及團隊簡介

論文作者為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹學(xué)碩士研究生尹一凡，博士生張留孜和科研助理張建婷為共同作者，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院汪良駒教授和仲巖副教授為通訊作者。

汪良駒教授是江蘇省植物生理學(xué)會植物生長物質(zhì)與生長調(diào)控委員會主任。他于2000年起開始從事ALA在農(nóng)林作物抗逆增產(chǎn)提質(zhì)效應(yīng)及其生物學(xué)基礎(chǔ)研究。其研發(fā)的產(chǎn)品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已經(jīng)大面積應(yīng)用于20多個省市區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)。其團隊先后獲得20多項政府專項資金資助，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表與ALA有關(guān)研究論文100余篇，授權(quán)專利20余項，處于5-A農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究前沿。本文是團隊成員相繼在Molecular Horticulture, Horticulture Research, Horticultural Plant Journal 等期刊發(fā)表論文后的又一新成果。