01研究背景

包括桃樹在內(nèi)的大部分落葉果樹的花期都在每年3月中旬至4月中旬。此時氣溫逐漸回升，但并不穩(wěn)定，時常乍暖還寒。北方冷空氣突然南下，倒春寒危害時有發(fā)生，極易引起花果的晚霜凍害。冬季休眠期的桃樹可以耐-25~-23℃低溫。脫休眠后，則耐寒性下降，尤其是花器官，對低溫極其敏感。開放的桃花在-2℃下4小時，其雌蕊將出現(xiàn)嚴(yán)重凍害，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響果樹生產(chǎn)和農(nóng)民收益。如何減少倒春寒引起的桃花雌蕊凍害具有重要理論價值和生產(chǎn)實踐意義。

早已研究發(fā)現(xiàn)，5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）能夠提高植物耐冷性。在桃樹上，它能提高葉片忍受-6℃低溫對光合作用能力的影響，促進(jìn)可溶性糖、脯氨酸以及可溶性蛋白質(zhì)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，提高抗氧化酶活性，減少活性氧損傷，顯著減輕桃樹葉片受到的凍害。但ALA是否能夠提高桃花雌蕊耐凍性能力尚鮮見報道，其內(nèi)在機理更未見報道。

02研究問題

人們對ALA是否能夠緩解花期低溫對桃花雌蕊的傷害及其分子機制尚不知曉。本研究以‘中油4號’油桃離體花枝為試材，篩選出受ALA調(diào)控的參與桃雌蕊低溫響應(yīng)的關(guān)鍵基因PpWRKY18，并驗證其生理功能，還尋找到其上游轉(zhuǎn)錄因子PpC3H37，探究了ALA緩解桃花雌蕊凍害的分子機理，旨在為果園預(yù)防倒春寒、?；ū９M(jìn)而提高桃樹產(chǎn)量提供理論依據(jù)和關(guān)鍵技術(shù)。

03研究結(jié)果

（1）以‘中油4號’油桃花枝為材料，研究發(fā)現(xiàn)，−3 ℃低溫6小時處理后花朵尤其是雌蕊受到嚴(yán)重凍害，雌蕊呈水漬狀，褐化，無生命跡象。如果提前一周用外源ALA預(yù)處理花枝，則桃花雌蕊受凍害程度明顯更輕（Fig. 1, A-C）。ALA處理可以提高低溫脅迫下桃花雌蕊抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低活性氧積累，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而提升雌蕊低凍性（Fig. 1, C-E）。RT-qPCR結(jié)果顯示，抗氧化酶基因（PpFeSOD3、PpPOD10/16/25/31/41、PpCAT和PpCAT-L），脯氨酸合成基因（PpP5CS1）與植物冷調(diào)節(jié)基因（PpCOR1）的表達(dá)均響應(yīng)低溫刺激，而ALA進(jìn)一步促進(jìn)這些基因上調(diào)表達(dá)（Fig. 1, F）。

Fig. 1 Exogenous ALA improves freezing hardiness of nectarine flowers

（2）通過RNA-seq分析和RT-qPCR檢測，我們篩選到一個響應(yīng)低溫和ALA處理的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PpWRKY18（Fig. 2）。組織特異性表達(dá)分析顯示，PpWRKY18在桃花雌蕊和雄蕊中表達(dá)水平最高（Fig. 2, C）。GUS與RT-qPCR檢測顯示，PpWRKY18啟動子活性受到低溫和ALA刺激，GUS基因表達(dá)水平顯著增加（Fig. 2, B, D）。

（3）在煙草中異源過表達(dá)（OE）-PpWRKY18能夠顯著緩解低溫對植株的傷害，ALA處理可以顯著提升低溫下煙草相關(guān)同源基因表達(dá)水平，提高植株抗氧化酶活性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，減少活性氧和丙二醛的積累，增強轉(zhuǎn)基因煙草的抗凍能力（Fig. 3），說明這是一個受ALA調(diào)控的能提高植物抗凍性的重要轉(zhuǎn)錄因子。

Fig. 3 Overexpression of PpWRKY18 enhances freezing hardiness of the transgenic tobacco plants

（4）研究發(fā)現(xiàn)，冷響應(yīng)CBF通路的核心基因PpCBF1受到低溫與ALA的誘導(dǎo)（Fig. 4, A）。Y2H、BiFC、LCI和Pulldown等試驗證實，PpWRKY18和PpCBF1在蛋白質(zhì)水平上存在互作（Fig. 4, B-E）。Y1H試驗表明，PpCBF1作為轉(zhuǎn)錄因子靶向結(jié)合PpP5CS1和PpCOR1啟動子，調(diào)控兩個抗凍功能基因表達(dá)（Fig. 4, F）。

Fig. 4 Identification of the interaction between PpWRKY18 and PpCBF1

（5）通過Y1H、EMSA和DLR試驗，我們發(fā)現(xiàn)，PpWRKY18能特異性結(jié)合到PpPOD41啟動子上的W-box，正向激活該基因表達(dá)（Fig. 5）。這為ALA誘導(dǎo)桃花雌蕊氧化平衡提供了分子依據(jù)。

Fig. 5 PpWRKY18 binds to the promoter of PpPOD41 to transcriptionally activate the gene expression

（6）在PpWRKY18 調(diào)控的上游，我們以proPpWRKY18為誘餌，通過酵母核文庫篩選，發(fā)現(xiàn)一個鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子PpC3H37（Fig. 6）。RT-qPCR與GUS結(jié)果顯示，proPpC3H37受低溫和ALA正調(diào)控（Fig. 6, A, B）。Y1H、EMSA和DLR證明，PpC3H37可以結(jié)合proPpWRKY18并正向調(diào)節(jié)其表達(dá)（Fig. 6, D-H）。

Fig. 6 PpC3H37 as a transcription factor, binds to the promoter of PpWRKY18 and activates its expression

04.意義和創(chuàng)新

花朵是果樹產(chǎn)量基礎(chǔ)，花凍則產(chǎn)量受損。本研究將ALA運用于防止桃樹倒春寒危害，并且證明，提前一周基部處理，ALA可以通過木質(zhì)部運輸?shù)酱迫?，緩?3℃低溫6小時脅迫傷害，揭示出響應(yīng)低溫和ALA的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PpC3H37和PpWRKY18，提出以PpC3H37-PpWRKY18模塊為核心的介導(dǎo)ALA增強桃雌蕊抗凍性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為闡明ALA提高植物抗凍性機理提供了科學(xué)依據(jù)，為ALA在果樹早春防寒、盛花后疏花以及保果提質(zhì)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014124002474